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ChIP-seq技术简介

2019-08-23 09:07:02 苏州汶颢微流控技术股份u9彩票 已读

染色质免疫沉淀后测序(ChIP seq)是一种针对DNA结合蛋白、组蛋白修饰或核小体的全基因组分析技术。由于二代测序技术的巨大进步,ChIP-seq比其最初版本ChIP-chip具有更高的分辨率、更低的噪声和更大的覆盖范围。随着测序成本的降低,ChIP- seq已成为研究基因调控和表观遗传机制不可或缺的工具。

1. 原理  

甲醛处理细胞使目标蛋白与DNA交联,通过超声波将交联后的染色质打断成小片段,一般在200-600bp范围内。再利用抗原抗体的特异性识别反应,将与目的蛋白相结合的DNA片段沉淀下来。最后,去交联并对纯化后DNA进行PCR扩增,高通量测序,最后与已有基因组序列进行比对,以确定 DNA与蛋白质结合的序列。

ChIP-seq技术简介

2.问题分析

2.1.甲醛交联对后续结果分析的影响?

自从Orlando V等人首次发明了ChIP技术,十几年后核心步骤仍无大变化。然而,ChIP-seq技术实际存在一定的缺陷,例如甲醛交联。甲醛虽然是一种高度渗透的交联剂,但由于其反应活性仅限于胺,因此其交联效率较低;对哺乳动物细胞而言,其最大交联效率仅为1%。因此甲醛交联细胞所需的起始量很大,也因此该技术也很难适用于微量细胞及单细胞样本。牛津大学出版社发表的文章In vivo formaldehyde cross-linking: it is time for black box analysis指出,某些蛋白质如:阻遏蛋白,NF-κB等无法通过甲醛交联到DNA上,研究表明;在DNA上的停留时间短于5秒的蛋白质无法用甲醛交联。其次,甲醛会导致许多其它无关蛋白质交联到DNA上,影响后续分析数据。有报道称,甲醛交联会触发DNA损伤应答机制,从而改变染色体组分,进而使ChIP结果产生偏向性。除此之外,由于交联反应在加热和低PH的情况下会发生逆转,因此DNA蛋与白质的交联复合物的稳定性也是一个值得关注的问题。因此,甲醛究竟在多大程度上能反应细胞内蛋白质的分布仍不能确定。

根据有无甲醛交联步骤可以把CHIP技术划分为两种类型,一类是存在甲醛交联的 ChIP,即X-ChIP(cross-linking and mechanical shearing ChIP);另一类是无交联存在的ChIP,即N-ChIP(native-ChIP);相较于X-ChIP,N-ChIP技术有一系列的优点,包括:高分辨率(MNase的使用使得染色体的片段化可以小至核小体)、避免了甲醛交联带来的非特异性蛋白在DNA上的富集、避免了甲醛交联对抗原表位的遮盖、步骤的减少降低了样品的损失等。然而,由于使用了MNase,N-ChIP只适用于研究组蛋白修饰,大部分情况下不能用于转录因子的研究。

2.2. 超声波打断和酶断裂方法的比较?

酶类:最常用的酶类如MNase,即:微球菌核酸酶,是一种能降解核小体连接区的DNA序列的核酸酶,最初从金黄色葡萄球菌中分离出来。MNase消化染色质可以释放出一个个独立的核小体。

MNase酶解法具有一定的局限性,首先,MNase对于偏向于切割A/T碱基位点,导致核小体在A/T富集区域的表达量低于真实情况;其次,MNase不能在核小体边界精确切割,这导致在确定染色质的开放位置与真实情况存在差异;而且,MNase偏向于消化脆性核小体。在不同物种的实验证据表明,脆性核小体占据了基因启动子和转录终止位点,而脆性核小体只在MNase浓度较低且消化时间较短的情况下才能被检测出来,因此很难将脆弱核小体量化到稳定核小体的相对丰度。

超声打断则不如酶裂解法温和,而且由于打断的不均匀性,导致测序结果背景噪音高,影响后续数据分析。由于文章篇幅限制,在此不多赘述。

那么究竟选择酶解还是超声打断,需要视情况而定。可参考以下建议:

如果所研究的蛋白质高丰度表达且与DNA结合紧密如组蛋白,那么样本无需需交联,这时可使用酶解法。

如果所研究的蛋白质表达丰度较低或与DNA结合不紧密如转录因子等,往往需要用交联试剂将样本进行固定,稳定蛋白质和DNA的形态,这时最好选用超声法进行断裂。

3.拓展  

3.1适用于微量细胞水平的ChIP技术及其原理

1)CUT-Tag技术

CUT-Tag可同时用于研究转录因子结合位点以及DNA的开放性。可在一天之内完成从细胞到建库完成的所有步骤,且具有高分辨率,低噪音等特点。起始细胞用量可低至50个。

原理

利用抗原抗体特异性反应,加入特异性抗体与染色体上目标蛋白结合,加入二抗与该抗体结合以募集更多的pA-Tn5转座酶复合物至目标蛋白与DNA序列的结合位点上,转座酶复合物切割该染色质开放位点,并在切割后的DNA片段两端加入接头,文库构建完成,可直接进行后续测序,与已有基因组序列比对,即可知道目标蛋白与DNA的结合位点。

CUT-Tag技术

2)ChIL-seq

ChILchromatin integration labelling),即染色质集成标签技术,可同时用于研究转录因子结合位点以及DNA的开放性,起始细胞用量为100-1000个细胞。ChIL-seq 避免了传统ChIP-seq技术中由于抗体沉淀所带来的回收率低的缺陷,尤其适用于贴壁细胞。对于活跃的组蛋白标记如H3K4me3 ,H3K27ac,起始细胞用量甚至可降低至单细胞水平。

原理

96孔板中加入细胞,经固定,染色后加入一抗与目标蛋白结合,随后加入ChIL探针(由二抗和ChIL DNA组成),探针中的ChIL DNATn5转座酶整合到目标蛋白所在基因组DNA附近,随后T7 RNA 聚合酶经ChIL DNA中的启动子启动转录,以此处基因组DNA为模板合成RNA,经DNase I消化和裂解释放RNA,以纯化的RNA建库测序。

ChIL-seq

3)Drop-ChIP

Drop-ChIP:使用了特定的微流控装置,分辨率可达到单细胞水平。该技术不仅可以在单细胞水平研究转录因子结合位点及组蛋白修饰,还可以从细胞特异性角度研究不同细胞间染色质的变异程度。u9彩票认为,整合单细胞染色质和单细胞表达数据,可以使调控元件与靶基因更精确地耦合,并更深入地了解它们的功能动力学和关系。

原理

首先,将待研究的细胞与裂解液,MNase混合进行染色质消化,另外设计一个包含很多种不同接头的液滴,在微流控装置上反应,使得每一个细胞液滴与一种接头液滴混合,同时与含有DNA连接酶的buffer液滴混合。这个过程中,接头序列自动连接到裂解的染色质片段两端,进而进行细胞裂解,使用特异性抗体对目标蛋白进行沉淀,对富集后的DNA进行测序。与已有基因组序列比对即可知道目标蛋白作用位点。

Drop-ChIP

参考文献:

[1]. 1: Kaya-Okur HS, Wu SJ, Codomo CA, Pledger ES, Bryson TD, Henikoff JG, Ahmad K,Henikoff S. CUT&Tag for efficient epigenomic profiling of small samples and single cells. Nat Commun. 2019 Apr 29;10(1):1930.

[2]. Harada A, Maehara K, Handa T, Arimura Y, Nogami J, Hayashi-Takanaka Y,

Shirahige K, Kurumizaka H, Kimura H, Ohkawa Y. A chromatin integration labelling method enables epigenomic profiling with lower input. Nat Cell Biol. 2019  Feb;21(2):287-296.

[3]. Rotem A, Ram O, Shoresh N, Sperling RA, Goren A, Weitz DA, Bernstein BE.

Single-cell ChIP-seq reveals cell subpopulations defined by chromatin state. Nat  Biotechnol. 2015 Nov;33(11):1165-72

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